一、介紹

散射光濁度法和透射光比濁法是基于光散射現(xiàn)象原理的分析技術。光散射是一種物理現(xiàn)象，其中光束由于與足夠小的物質(zhì)粒子相互作用而改變其傳播方向（稱為偏轉(zhuǎn)）。根據(jù)麥克斯韋電磁理論，散射發(fā)生的先決條件是懸浮顆粒的折射率必須不同于懸浮液體的折射率。差異越大，散射越強烈。

光散射有兩種類型：1）彈性散射，其中散射光和入射光的波長相同；2）非彈性光散射，其中散射光和入射光的波長不同。只有種光散射（彈性）與散射光濁度法和透射光比濁法有關。

在透射光比濁法中，測量透射光的強度，并在入射光方向（即0°）測量散射導致的入射光強度的衰減，并與入射光強度進行比較（測量）。被測特性是懸浮顆粒散射效應的間接測量，稱為濁度。懸浮樣品對光的任何吸收都會導致光強度的額外衰減（參見<857> Ultraviolet-Visible Spectroscopy和<1857> Ultraviolet-Visible Spectroscopy—Theory and Practice）。因此，確保被測材料不會吸收測量波長處的光非常重要。實際上，控制吸收和濁度測定的方程式是相同的（盡管衰減常數(shù)的值不同）。在散射光濁度法中，測量與入射光傳播方向成90°角的散射光強度。因此，散射光濁度法濁度測量是對懸浮物散射效應的直接測量。

二、術語和定義

描述濁度法和濁度法的常用術語包括：

?濁度（符號S）：由于懸浮顆粒的光散射效應，透射入射光束強度降低的一種度量。懸浮物的量可以通過觀察透射光（比濁法）或散射光（濁度法）來測量。

log I0/It = kbc = T

I0=入射光強度

It=透射光強度

k=摩爾濁度系數(shù)

b=樣品池路徑長度

c=濃度

T=濁度

?濁度（符號，&tau;）：在透射光濁度測量中，濁度是給定懸浮液的入射光束強度/單位長度減少的量度。標準化組織將濁度定義為”由于存在未溶解物質(zhì)而導致液體透明度降低”。

?濁度測量單位：渾濁度單位用一個描述符表示，該描述符指示測量方法。

?散射光濁度計濁度單位（NTU）：當使用散射光濁度法測量濁度時，濁度計以與入射光傳播方向成90°角的角度測量散射光，濁度單位稱為散射光濁度法濁度單位（NTU）。NTU的大小是根據(jù)初級福爾馬肼標準品（一種將硫酸肼和六亞甲基四胺溶液混合在水中制成的懸浮液）產(chǎn)生的濁度定義的。更的聚合物微珠懸浮液現(xiàn)已上市，并被公認為可接受的替代品。然而，所有這些標準都可以追溯到福爾馬肼。初級福爾馬肼標準溶液的濁度為4000 NTU。

其他公認的濁度單位包括福爾馬肼比濁法單位（FTU）和福爾馬肼濁度法單位（FNU）。這些單位相當于0-40 NTU范圍內(nèi)的NTU。

三、應用

透射光比濁法和散射光濁度法技術的應用包括1）溶液和/或懸浮液的濃度測定（通過在控制良好的反應參數(shù)下沉淀和懸浮產(chǎn)生的沉淀物，來測定幾種陽離子和陰離子）；2）測量混濁溶液或懸浮液的濁度；3）測定分子量在1000到數(shù)億之間的多分散體系的重均分子量和尺寸；4）測量免疫分析的反應動力學或免疫沉淀動力學（比率散射濁度法）；5）監(jiān)測細胞和的生長；6）懸浮物粒度分布測定、顆粒計數(shù)等。

比率散射濁度法廣泛用于疫苗成分分析和/或血清成分的定量。它還用于重組生物制藥中的宿主細胞蛋白質(zhì)鑒定。當使用該技術時，通過測量抗原-抗血清或抗原純化抗體復合物的光散射反應的變化，來計算導致免疫抗體-抗原沉淀反應或凝集反應的抗原（Ag）或抗體（Ab）的量。通?？紤]抗原共價連接或吸附在聚合物微球上，以提高散射效率；由此產(chǎn)生的技術被稱為”顆粒增強免疫分析”。雖然這項技術被稱為散射光濁度法，但通常散射光和透射光都是用比率儀器測量的。

散射光法濁度測量在低濁度范圍（散射介質(zhì)濃度相對較低）更可靠。在該范圍內(nèi)，觀察到樣品濃度與檢測器信號強度（以NTU表示）之間存在線性關系。隨著濃度的增加，多次散射的入射角也會增加，從而偏離線性響應。支持可靠線性關系的NTU值在1750–2000 NTU范圍內(nèi)。透射光比濁法適用于更高的濁度范圍（散射介質(zhì)的濃度）。為了獲得一致的結(jié)果，必須仔細控制所有測量變量。在可能的情況下，可以測量稀的懸浮液。

四、儀器儀表

用于透射光比濁法和散射光濁度法測量的儀器分別稱為透射光濁度計和散射光濁度計。通常，這些儀器包括一個帶有濾光器的汞燈（用于強綠線或藍線）、一個快門、一組具有已知透射率的中性濾光器和一個靈敏的光電倍增管，該光電倍增管可安裝在與入射光傳播方向成0°或90°角的位置，或者在一個臂上，它可以圍繞溶液單元旋轉(zhuǎn)，并通過不透光外殼外的表盤設置為&minus;135°到0°到+135°的任何角度。溶液池的形狀多種多樣，例如用于測量90°散射的正方形；45°、90°和135°散射為半八角形；圓柱形可適用于所有角度的散射（見圖1）。

 圖1.代表性濁度儀。注意，探測器2可安裝在可移動臂上。

濁度也可以用標準光電濾光光度計或分光光度計測量，是在光譜的藍色部分進行照明。散射光濁度法測量需要一個裝有光電管的儀器，以便接收散射光，而不是透射光。由于這與熒光計中使用的幾何結(jié)構(gòu)相同，因此可通過適當選擇濾光片將其用作濁度計。比率濁度計結(jié)合了90°散射光濁度法和透射光比濁法。它包含光電管，接收和測量與樣品成90°角的散射光，以及接收和測量樣品前面的前向散射光。它還測量直接穿過樣品的光。通過90°角散射光測量值，前向散射光測量值和透射光測量值之和，計算兩者的比值，可獲得線性度。使用比率濁度測量系統(tǒng)的好處是雜散光的測量變得可以忽略不計。此外，彩色懸浮液的濁度測定僅使用透射光比濁法濁度儀或濁度儀（帶比率模式）進行，因為該程序補償了懸浮液顏色導致的光衰減。通常，這些儀器中的光源是鎢燈，在2700 K的燈絲溫度下工作，大部分光強約為550 nm。也可使用其他合適的光源。通常，探測器是▲硅二管▲和光電倍增管。另一種顏色效應的方法是使用紅外發(fā)光二管作為光源，其發(fā)射中心約為860 nm，光譜帶寬為60 nm。當激光光源也被使用時，尤其是在濁度測量儀器中，這種技術通常被稱為”激光濁度測量”。使用激光散射光濁度計的優(yōu)點是，在非常低的檢測水平下，信噪比顯著提高。通常光源是工作波長為660 nm的激光二管。激光束的高功率密度使較小粒子產(chǎn)生更高的散射強度。與吸收未散射光的光阱相結(jié)合，該系統(tǒng)可顯著降低雜散光。當專著中的某個程序指示使用散射光濁度計或透射光濁度計時，可以使用在比率模式下工作的儀器。

五、福爾馬肼濁度標準

福爾馬肼是目前已知的主要濁度標準。所有其他標準都是次要的，必須追溯到福爾馬肼。 主要標準在▲IUPAC Compendium of Chemical Terminology▲（ERR 1-May-2019）第 2 版（金書）中被定義為由用戶使用明確定義的方法和條件從可追溯的材料準備的標準。

福爾馬肼懸浮液有許多特點，以確保其適合作為主要標準。它可以從試劑級的起始材料中始終如一、準確地制備。該懸浮液由不同長度和隨機構(gòu)型的聚合物組成，其組成的聚合物的形狀和尺寸從小于0.1 &mu;m到大于10 &mu;m不等。盡管聚合物鏈長分布已被證明因制備而異，但總的濁度結(jié)果是可以很好地重現(xiàn)的。

 5.1 Preparation of the Formazin Standards 福爾馬肼標準液的制備

?硫酸肼溶液：將1.000 g ACS級硫酸肼（N2H4&middot;H2SO4）溶解在100 mL 的A類容量瓶中中，并用無顆粒水稀釋至刻度。讓該溶液靜置4-6小時。

?初級福爾馬肼標準液：將2.50 g分析級六亞甲基四胺[(CH2)6N4]溶于25.0 mL無顆粒水中，裝入100 mL燒瓶。使用A類25 mL移液管加入25.0 mL硫酸肼溶液，并充分混合。使用前，讓制劑在25±1°的溫度下靜置48小時。由此產(chǎn)生的懸浮液可穩(wěn)定運行2個月。

?福爾馬肼儲備標準懸浮液1：使用15 mL A類移液管，將15 mL福爾馬肼初級標準液轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，并用無顆粒水稀釋至刻度并混合。所得懸浮液的濁度為60 NTU。

?福爾馬肼儲備標準懸浮液2：使用50 mL A類移液管，將50 mL福爾馬肼初級標準液轉(zhuǎn)移至200 mL容量瓶中，并用無顆粒水稀釋至刻度并混合。所得懸浮液的濁度為1000 NTU。

?福爾馬肼參考懸浮液：根據(jù)表1，在100 mL容量瓶中混合各份福爾馬肼儲備標準懸浮液和無顆粒水，制備福爾馬肼參考懸浮液。

六、透射光式濁度儀與散射光式濁度儀的鑒定

特定儀器對給定程序的適用性由從選擇到儀器報廢的預期應用的逐步生命周期評估來確保。鑒定包括三個部分：1）安裝鑒定（IQ）、2）操作鑒定（OQ）和3）性能鑒定（PQ）（參見<1058>Analytical Instrument Qualification章節(jié)）。

本節(jié)的目的是提供測試方法和驗收標準，以確保儀器適合其預期用途（OQ），并在延長的時間段（PQ）內(nèi)繼續(xù)正常工作。與任何光譜儀一樣，透射光式和散射光式濁度光譜儀必須具備波長（x軸）和光度（y軸或信號軸）的準確度及精度，并滿足雜散光的要求。OQ是在實驗室內(nèi)吸光度和波長標度所需的操作范圍內(nèi)進行的。

在IQ和OQ期間，驗證確定”用途適用性”的關鍵儀器參數(shù)的驗收標準。特定儀器和應用的規(guī)格可能因使用的分析程序和終結(jié)果的預期準確度而異。儀器供應商通常將樣品和測試參數(shù)作為IQ/OQ包的一部分提供。

在以下詳述的程序中，應盡可能使用主要參考標準或認證參考材料（CRM）。福爾馬肼是比濁法和濁度法中目前使用的主要參考標準。所有其他標準，包括CRM，必須與福爾馬肼相關。CRM應從認可的認證來源獲得，并包括獨立驗證的可追溯值分配及相關的計算不確定性。CRM必須保持清潔，無灰塵。應定期進行重新認證，以保持認證的有效性。

 1、校準

所有透射光式濁度儀和散射光式濁度儀均根據(jù)已知濁度的標準進行校準。在初次使用之前，必須使用福爾馬肼濁度標準液對儀器進行校準，至少每3個月或按照供應商的規(guī)定進行一次校準。使用至少四種福爾馬肼濁度標準液進行校準，其濁度按比例覆蓋感興趣的范圍。許多儀器制造商提供校準驗證標準。它們通常由其中充滿聚合物凝膠中的金屬氧化物顆粒的密封樣品池或乳膠懸浮液組成。這些標準只能用于檢查儀器推薦校準的時間間隔內(nèi)的校準。

 2、Stray Light雜散光

雜散光(雜散光輻射能)是一個非常重要的誤差源，特別是在較低的濁度讀數(shù)范圍內(nèi)的測量。它被定義為到達探測器而不被樣品散射的外部光線。雜散光有幾種來源，包括電池表面固有缺陷、電池內(nèi)部未被解釋的反射、光學系統(tǒng)部件、光源，以及在較小程度上的電子波動。盡管儀器供應商使用了許多設計功能來小化雜散光，但無法*緩解雜散光。與分光光度測量不同，濁度法無法補償雜散光。必須測量雜散光，其值應在特定儀器供應商設定的規(guī)格范圍內(nèi)，或在0-10 NTU范圍內(nèi)測量時小于0.15 NTU，在10-1100 NTU范圍內(nèi)測量時小于0.5 NTU，以較小者為準。

3、測量能力的范圍

儀器必須能夠測量0.01–1100 NTU范圍內(nèi)或目標濁度50%-200%范圍內(nèi)的濁度。為了證明預期測量范圍的線性，從表1中選擇至少四種合適的參考懸浮液。

4、解決方案

對于0-9.99 NTU的測量范圍，儀器分辨率必須小于等于0.01 NTU；測量范圍為10-99.9 NTU時，小于等于0.1 NTU；100 NTU以上的測量分辨率值為1 NTU。

5、準確度

對于0-19.9 NTU的測量范圍，儀器讀數(shù)準確度必須為讀數(shù)+0.01 NTU的±10%，對于20-1100 NTU的測量范圍，儀器讀數(shù)準確度必須為讀數(shù)的±7.5%。

6、性能鑒定

定期或根據(jù)需要在校準期之間完成儀器PQ。可使用儀器制造商提供的一級濁度標準（福爾馬肼）或二級校準驗證標準（乳膠懸浮液或密封樣品池中聚合物凝膠中的金屬氧化物顆粒）。

七、步驟

1、透射光比濁法測試步驟

樣品池準備

用于樣品測量的樣品室必須清潔。按照樣品池或儀器制造商的建議適當清潔樣品池。對于低濁度測量，使用一個單指數(shù)樣品池或流動池，這有助于確保測量的足夠精度和可重復性。使用無顆粒水，在樣品池支架中找到讀數(shù)較低的樣品池方向。對于較高的濁度值，可使用不同的樣品池。然而，樣品池必須匹配（兩個不同樣品池在標稱樣品濃度下制備的標準品讀數(shù)差異必須在±0.005 NTU范圍內(nèi)或低于測量精度要求，以較低者為準）。

樣品準備

按照各專題中的規(guī)定制備樣品。通過緩慢旋轉(zhuǎn)或倒置容量瓶數(shù)次，仔細混合樣品。避免搖晃或攪拌，因為這可能會產(chǎn)生氣泡。對樣品進行脫氣有助于改進測量。對于脫氣，樣品可以靜置幾分鐘，或者可以施加真空，或者可以使用超聲波浴對其進行輕輕的超聲波處理。脫氣后，讓樣品靜置幾分鐘，然后小心地反轉(zhuǎn)兩到三次，再次混合。將樣品轉(zhuǎn)移至樣品池并讀取讀數(shù)。

流動池的使用

流動池主要用于小顆粒樣品的低濁度測量。當使用這種樣品池時，通過小心地將樣品倒入進水倉的內(nèi)邊緣來引入樣品。

在實際過程中，建議確保被測顆粒的沉降可以忽略不計。這通常通過在液體懸浮介質(zhì)中加入保護膠體來實現(xiàn)。重要的是，通過將讀數(shù)與在*相同的條件下產(chǎn)生的已知懸浮物濃度的讀數(shù)進行比較來解釋結(jié)果。

2、散射光濁度法步驟

散射光濁度法步驟的執(zhí)行方式與透射光比濁法程序類似，適用于直接測量和上述比率模式下的測量。

比率模式散射光濁度法步驟

監(jiān)測反應進程的總體程序包括三個明確定義的步驟：

1）記錄介質(zhì)濁度的基線讀數(shù)（）；

2）在添加種試劑（抗原）后，記錄濁度，這會導致濁度增加，直到達到一個穩(wěn)定期；

3）添加第二種試劑（抗體），這會導致另一個濁度增加和第二個穩(wěn)定期，然后是終濁度增加，直到達到第三個穩(wěn)定器。根據(jù)分析目的和各自的組分濃度，從添加抗體到第三個穩(wěn)定期中間選擇測量區(qū)。動力學散射比濁法和終點散射比濁法是兩種通用程序，用于量化免疫分析方法中形成的免疫復合物（也稱為免疫散射比濁法，因為測得的濁度是由形成的免疫復合物引起的）。

對于每一個步驟，都有幾個參數(shù)需要在每個單獨的應用中進行優(yōu)化。

主要參數(shù)為

1）有無粒子增強；

2）顆粒類型、尺寸和各自的波長（如適用）；

3）監(jiān)測反應動力學或終點；

4）考慮中的抗體/抗原，以及與之相關的抗原負載的水平；

5） 緩沖液和其他離子種類以及各自的pH值；

6）用于改變蛋白質(zhì)溶解度的聚合物的類型和濃度；

7）溫度和其他環(huán)境因素。通常，這些參數(shù)在方法開發(fā)過程中進行了優(yōu)化，具體的專著和/或章節(jié)（如適用）中給出了這些值。

動力學散射比濁法：與終點散射比濁法相比，動力學散射比濁法具有優(yōu)勢，主要是因為除了試劑讀數(shù)外，還能夠讀取樣品讀數(shù)。該程序基于所選波長的散射光的增強強度響應來評估免疫復合物的形成速率。根據(jù)所用儀器的時間響應和應用類型，可連續(xù)監(jiān)測反應動力學，或采集一定數(shù)量的數(shù)據(jù)點。有時它可能只涉及兩個數(shù)據(jù)點；但是在樣品和校準標準之間存在反應動力學差異的情況下，選擇點可能會影響整體準確度。應仔細考慮特異性控制策略的適當選擇。

終點散射比濁法：在該方法中，在添加試劑之前進行初始測量，這代表讀數(shù)。大約60分鐘后，在免疫復合物形成后進行第二次測量。這兩次測量之間的差異與所分析成分的含量成正比。

八、驗證與核查

1、驗證

當散射比濁法/透射濁度法擬用作物品測試程序的替代方法時，需要進行驗證。當散射比濁法/透射濁度法驗證的目的是證明測量適用于其預期目的，包括原料藥或藥品中主要成分的定量測定（I類分析）、雜質(zhì)的定量測定或限度試驗（II類）以及鑒定試驗（IV類）。根據(jù)試驗的類別（參見<1225>Validation of Compendial Procedures，表2），透射濁度法/散射比濁法的分析方法驗證過程需要對準確度、精密度、特異性、檢測限（DL）、定量限（QL）、線性、范圍和穩(wěn)健性進行試驗。這些分析性能特征適用于外部標準化程序和那些使用標準添加的程序。

<1225>Validation of Compendial Procedures章節(jié)提供了分析程序驗證的定義和一般指南，但沒有說明每個特征的具體驗證標準。以下各節(jié)的目的是向用戶提供具體的驗證標準，這些標準代表了對該技術的較低期望。對于每個特定應用，可能需要更嚴格的標準，以證明其適用于預期用途。

 1）準確度

對于I類、II類和III類程序，可通過使用加入已知分析物濃度的適當基質(zhì)進行回收研究來確定準確度。分析員還可以將使用驗證中的散射光濁度法/透射光比濁法程序獲得的分析結(jié)果與已建立的分析程序獲得的結(jié)果進行比較。

驗證標準：原料藥的平均回收率為98.0%–102.0%，藥品分析的平均回收率為95.0%–105.0%，雜質(zhì)分析的平均回收率為80.0%–120.0%。這些標準在整個規(guī)定范圍內(nèi)都得到滿足。

 2）精度

重復性：通過測量六種獨立制備的樣品溶液在分析試驗濃度下的濃度來評估分析程序的重復性?；蛘?，可以通過測量三種不同濃度的單獨樣品溶液的三個重復的濃度來評估。三種濃度應足夠接近，以便在整個濃度范圍內(nèi)重復性保持恒定。如果這樣做，將三種濃度下的重復性匯總，以與驗收標準進行比較。

驗證標準：原料藥的相對標準偏差為NMT 1.0%，藥品分析的相對標準偏差為NMT 2.0%，雜質(zhì)分析的相對標準偏差為NMT 20.0%。

中間精度：必須確定隨機事件對方法分析精度的影響。典型的變量包括在不同的日期使用不同的儀器進行分析，和/或由兩名或兩名以上的分析員進行分析。至少，這些因素中的至少兩個的組合，總共6個實驗，將提供中等精度的評估。

驗證標準：原料藥的相對標準偏差為NMT 1.5%，藥品分析的相對標準偏差為NMT 3.0%，雜質(zhì)分析的相對標準偏差為NMT 25.0%。

3）特異性

在散射光濁度法/透射光比濁法的濁度測量中，特異性通過基質(zhì)中其他成分的干擾（基質(zhì)的其他成分產(chǎn)生真實溶液）的缺乏來證明。

4）檢測限

可以通過計算溶液的濃度來估計檢測限D(zhuǎn)L，該濃度將給出信號的信噪比&ge;3.3. 必須通過分析計算濃度下的樣品來確認估計的DL。

5）定量限

定量限QL可以通過計算溶液的濃度來估算，該濃度將給出信號的信噪比&ge;10.0. 必須通過分析計算濃度下的樣品來確認估算的QL。必須對以所需QL濃度添加的代表性樣品基質(zhì)制備的試液進行測量，以確認其具有足夠的靈敏度和精度。在所需QL下觀察到的信噪比應大于10。

驗證標準:估計的定量限被認為是有效的，測量的濃度必須是準確的，并且在≤50%的規(guī)格水平上是的。

6）線性

分析物濃度和測得的濁度響應之間的線性關系必須通過制備至少四種標準溶液來證明，其濃度包括試驗溶液的預期濃度。然后使用適當?shù)慕y(tǒng)計方法（如小二乘回歸）評估標準曲線。通過降低或增加分析物濃度，可將儀器或樣品因素或兩者的線性偏差降低至可接受水平，從而分別將濁度讀數(shù)降低或增加至透射光法濁度計/散射光濁度計儀器線性范圍內(nèi)。

驗證標準：對于I類分析，相關系數(shù)（R）必須為NLT 0.995，對于II類定量測試，相關系數(shù)（R）必須為NLT 0.99。

7）范圍

分析儀器（以及整個分析程序）的操作范圍是樣品中分析物的上下濃度（數(shù)量）（包括這些濃度）之間的間隔，已證明儀器響應函數(shù)具有適當?shù)木?、準確度和線性水平。

驗證標準：對于I類試驗，100.0%中心驗收標準的驗證范圍為80.0%–120.0%。對于非中心驗收標準，驗證范圍為下限以下10.0%到上限以上10.0%。對于II類試驗，驗證范圍涵蓋驗收標準的50.0%–120.0%。

穩(wěn)健性

分析測量的可靠性通過有意改變實驗參數(shù)來證明。 對于散射光濁度法/透射光比濁法，這可以包括：測量分析物在特定儲存條件、變化的 pH 值和添加可能的干擾物質(zhì)下的穩(wěn)定性。使用適合實驗程序的設計，同時確保穩(wěn)健性。

2、核查

現(xiàn)行的《美國生產(chǎn)規(guī)范條例》[21 CFR 211.194（a）（2）]表明，如果專論中提供了這些程序，則美國藥典和集中描述的分析程序的用戶無需驗證這些程序。相反，他們只需驗證其在實際使用條件下的適用性。

散射光濁度法/透射光比濁法程序驗證的目的是證明測試程序在實際使用條件下的適用性。驗證散射光濁度法/透射光比濁法程序適用性的性能特征與任何分析程序所需的性能特征相似。適用的一般原則的討論見<1226>Verification of Compendial Procedure 章節(jié)。通常使用參考材料和明確定義的基質(zhì)進行驗證。 藥典散射光濁度法/透射光比濁法程序的驗證至少包括對特異性、準確度、精密度和 QL 的驗證參數(shù)的執(zhí)行（如 8.1 驗證中所述）。

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