動態(tài)濁度法鱟試劑是通過檢測反應(yīng)混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間,或是檢測濁度增加速度來檢測內(nèi)毒素的方法。在適宜的條件下(溫度,pH值及無干擾物質(zhì)),內(nèi)毒素C因子,引起一系列酶促反應(yīng),使鱟試劑產(chǎn)生凝集反應(yīng)形成凝膠。隨著凝膠的形成,反應(yīng)液的吸光度(OD值,濁度)增加,OD值增加的速度與內(nèi)毒素濃度成正相關(guān)。換言之,OD值上升某一預(yù)設(shè)限值(啟動OD)所需要的時(shí)間(定義為啟動時(shí)間)與內(nèi)毒素濃度成負(fù)相關(guān),啟動時(shí)間的對數(shù)與內(nèi)毒素濃度的對數(shù)成線性關(guān)系,據(jù)此,可以定量供試品的內(nèi)毒素濃度。
動態(tài)濁度法鱟試劑操作方法如下:
1、動態(tài)光度測定儀器的設(shè)定:預(yù)熱儀器,設(shè)置溫育溫度為37℃,設(shè)置模板及程序。設(shè)定讀板波長為340nm、630nm,設(shè)定動力學(xué)參數(shù):讀板90-120分鐘,每讀板間隔30-150s。
2、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線所采用的內(nèi)毒素濃度可以為2至10倍稀釋的系列(如0.5,0.25,0.125,0.0625EU/mL或10,1,0.1,0.01EU/mL))。
(2)取內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品1支,用砂輪沿安瓿頸部劃痕,開啟,加入適量(建議在0.5mL-1.2mL之間)內(nèi)毒素檢查用水,置旋渦混合器上劇烈振搖5分鐘。
(3)將上述內(nèi)毒素溶液進(jìn)一步用內(nèi)毒素檢查用水稀釋成所需濃度,每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上劇烈振搖1分鐘。稀釋的內(nèi)毒素溶液靜置時(shí)間超過10分鐘,用前在旋渦混合器上劇烈振搖1分鐘,配置時(shí)間超過4小時(shí)的內(nèi)毒素溶液應(yīng)丟棄。3、陰性對照為內(nèi)毒素檢查用水。
4、動態(tài)濁度法鱟試劑的溶解:按標(biāo)示量加內(nèi)毒素檢查用水于鱟試劑中,輕輕振搖使鱟試劑*溶解。注意不要用旋渦混合器劇烈振搖。溶解的鱟試劑應(yīng)在10分鐘內(nèi)使用。若采用多道移液器,將溶解的鱟試劑轉(zhuǎn)移到除熱原加樣槽,并輕輕搖勻。
5、實(shí)驗(yàn)操作:
(1)取除熱原微板,在各孔中分別加入100mL內(nèi)毒素檢查用水、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,或供試品。
(2)將微板放置于鱟試儀中,37℃溫育10分鐘。
(3)溫育結(jié)束,用移液器或多道移液器加入100mL鱟試劑(避免產(chǎn)生氣泡!),中速振搖10秒混勻,在340nm波長處,每30秒(到60秒)讀一次,讀板120分鐘。